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技术文章  
ELISA检测样品的处理方法
点击次数:1715 发布时间:2013-09-12

 

通常我们可用于ELISA检测的样本是有多种类型的,如血清、血浆、尿液、细胞培养上清或组织匀浆液等,不同类型的检测样本前期的处理方法是不一样的。正确的处理样本是保证ELISA检测的正确性和准确性的*步,下面简单介绍一下不同类型的样本的处理方法。

1  血清

血清是zui常用于ELISA检测的一类样本,处理也比较简单。

用无热原、无内毒素的试管或离心管采集血液标本,将试管或离心管室温放置2小时或4℃过夜,使血清析出。(将试管或离心管倾斜放置,使液面横截面增大,能使血清更大程度的析出。)41000×g离心20分钟,仔细收集上清。建议将血清分装多份,-20℃或-80℃保存,避免反复冻融。

采血过程中应避免溶血,因为红细胞裂解时会释放具有过氧化酶活性的物质,在以HRP为标记的ELISA检测中会有非特异性的显色,而导致检测的不准确性。同时也应避免细菌污染,因为菌体内可能含有内源性的HRP从而导致检测的假阳性。

2  血浆

用含抗凝剂的采血管或离心管采集血液标本,标本采集后30min4 1000×g离心15min,取上清即血浆。将上清分装多份,-20℃或-80℃保存,避免反复冻融。避免使用溶血或高血脂的标本。

常用的抗凝剂为EDTA、肝素钠和枸橼酸钠等,检测时还应仔细阅读试剂盒说明书,检查试剂盒是否对抗凝剂有特殊要求。

3  细胞培养上清

取细胞培养上清到离心管,1000×g离心20min,除去细胞碎片及杂质,取上清,-20℃或-80℃保存,避免反复冻融。

4  细胞裂解液

1  吸去培养板内的培养基,用胰酶消化细胞,加适量培养基将细胞从培养板上吹下来。悬浮细胞可省略。

2  收集细胞悬液,1000×g离心10min,弃去培养基,用预冷的PBS润洗3次。

3  加入适量的预冷PBS或细胞裂解液(临用前加入蛋白酶抑制剂)重悬细胞。通常6孔板一个孔的细胞量需要150~250μL PBS重悬。

4  将样品放入-20℃或-80℃,使样品冷冻,再放室温解冻样品,反复冻融几次,使细胞充分裂解。也可将样品进行超声破碎,以达到裂解的目的。

5  4 10000×g 离心10min,除去细胞碎片,取上清,-20℃或-80℃保存,避免反复冻融。

5、组织匀浆液

1  将组织样本用PBS (0.01M, PH 7.4) 冲洗,洗去组织表面残留的血液或杂质。

2  将组织块称重,记录后剪碎,碎块应尽量小,便于匀浆得更充分

3  将组织按一定的比例加入预冷的PBS(临用前加入蛋白酶抑制剂)匀浆,匀浆时置于冰上或冰浴中。(通常按组织重量:PBS体积=1:9的比例匀浆,例如1g的组织样本对应9mLPBS,具体体积可根据实验需要适当调整,检测后计算样品浓度时应乘以相应的稀释倍数)

4  吸取匀浆液到离心管,4 5000×g 离心5~10min,取上清,-20℃或-80℃保存,避免反复冻融。

6  尿液、唾液等其他液体生物样本

1000×g离心20min,取上清即可检测。

总的来说,因为ELISA只能检测可溶性蛋白的含量,所以应保证所有样本均为澄清的液体,沉淀或悬浮物都应离心去除。

为了保证检测的准确性,保存于-20℃或-80℃的样本在1~6个月内检测;4℃保存的样本应在1周内进行检测。

另外,还应保证样本不含NaN3,因为NaN3会抑制HRP的活性,从而导致假阴性的结果。

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